જીવવિજ્ઞાનના અણુઓનું ક્ષેત્રે-ક્ષેત્રે સચોટ ચિત્ર: ક્રાયો-ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપીની અજાયબી
કોષો અને પ્રોટીનની અણુસ્તરીય સંરચના સમજવામાં ક્રાંતિ લાવનાર ક્રાયો-ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપી (Cryo-EM) કેવી રીતે કામ કરે છે અને તેણે નોબેલ પુરસ્કાર સુધીની સફર કેવી રીતે કાપી.
જીવવિજ્ઞાનના ઇતિહાસમાં જૈવિક અણુઓ (biomolecules) જેવા કે પ્રોટીન, વાયરસ અને ડીએનએની ત્રિપરિમાણીય (૩D) સંરચના જોવી એ હંમેશા એક મોટો પડકાર રહ્યો છે. પરંપરાગત ટ્રાન્સમિશન ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપ (Transmission Electron Microscope - TEM) માં વપરાતા હાઇ-એનર્જી ઇલેક્ટ્રોન બીમ નાજુક જૈવિક નમૂનાઓને બાળીને નષ્ટ કરી દેતા હતા. આ સમસ્યાનો ગ્રાઉન્ડબ્રેકિંગ ઉકેલ લાવવા માટે ૧૯૭૦ના દાયકામાં ક્રાયો-ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપી (Cryogenic electron microscopy - Cryo-EM) તકનીકની શરૂઆત થઈ, જેણે અણુજીવવિજ્ઞાન (structural biology) માં એક નવો યુગ શરૂ કર્યો છે.
Nature Methods સામયિકે ૨૦૧૫ માં ક્રાયો-EM ને "મેથડ ઓફ ધ યર" (Method of the Year) તરીકે ચૂંટ્યું હતું. ત્યારપછી વર્ષ ૨૦૧૭ માં જેક્સ ડુબોચેટ (Jacques Dubochet), જોઆકિમ ફ્રેન્ક (Joachim Frank) અને રિચર્ડ હેન્ડરસન (Richard Henderson) ને આ તકનીકના વિકાસ માટે રસાયણશાસ્ત્રનું નોબેલ પુરસ્કાર (Nobel Prize in Chemistry) આપવામાં આવ્યું હતું. આ ટેકનોલોજી દ્વારા વૈજ્ઞાનિકો દ્રાવણમાં રહેલા જૈવિક અણુઓની રચનાને પરમાણુ-સ્તરીય રિઝોલ્યુશન (near-atomic resolution) પર જોઈ શકે છે.
વિટ્રિયસ આઇસ: અણુઓને કુદરતી સ્થિતિમાં ફ્રીઝ કરવાની કળા
ક્રાયો-EM નું સૌથી મહત્વનું પાસું નમૂનાને થીજાવવાની ખાસ પદ્ધતિ છે. જ્યારે જૈવિક નમૂનાને સામાન્ય રીતે ઠંડો કરવામાં આવે છે, ત્યારે પાણીના સ્ફટિકો (ice crystals) બને છે જે કોષો અને પ્રોટીનની નાજુક સંરચનાને તોડી નાખે છે. આ સમસ્યાથી બચવા માટે આક્વિયસ નમૂનાને અતિ ઝડપથી લિક્વિડ ઇથેન (liquid ethane) અથવા લિક્વિડ ઇથેન-પ્રોપેનના મિશ્રણમાં મુકવામાં આવે છે, જેનાથી પાણી સ્ફટિક બનવાને બદલે અસ્ફટિકીય અથવા 'કાચ જેવો બરફ' (vitreous ice) બની જાય છે.
જૈવિક દ્રાવણને એક નાની સેમ્પલ ગ્રીડ (sample grid mesh) પર મુકીને તેને -૧૯૬ °C (૭૭.૧ K) જેટલા અતિશય ઓછા તાપમાને ફ્લેશ-ફ્રીઝ કરવામાં આવે છે. આ વિટ્રિયસ આઇસની અંદર પ્રોટીન અથવા વાયરસના અણુઓ પોતાની કુદરતી સ્થિતિમાં જ થીજી જાય છે. આ કારણે ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપના અત્યંત શક્તિશાળી વેક્યુમ (vacuum) અને ઇલેક્ટ્રોન બીમ સામે પણ આ અણુઓ સુરક્ષિત રહે છે.
- સેમ્પલ પ્રિપરેશન અને ફ્લેશ-ફ્રીઝિંગપ્રોટીન દ્રાવણને સેમ્પલ ગ્રીડ પર મુકી લિક્વિડ ઇથેનમાં -૧૯૬ °C તાપમાને ફ્લેશ-ફ્રીઝ કરીને વિટ્રિયસ આઇસ તૈયાર કરાય છે.
- લો-ડોઝ TEM ઇમેજિંગટ્રાન્સમિશન ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપ દ્વારા થીજેલા અણુઓ પર ઓછો ઇલેક્ટ્રોન ડોઝ આપીને હજારો ૨D છબીઓ લેવાય છે.
- ૨D અલાઇનમેન્ટ અને ક્લાસિફિકેશનRELION અથવા CryoSPARC સોફ્ટવેર વડે અણુઓની વિવિધ દિશામાંથી લેવાયેલી છબીઓનું વર્ગીકરણ કરાય છે.
- ૩D મોડેલ રિકન્સ્ટ્રક્શનવર્ગીકૃત છબીઓનો ઉપયોગ કરીને પ્રોટીનનો ૩D ડેન્સિટી મેપ અને આણ્વિક મોડેલ તૈયાર કરવામાં આવે છે.
કામગીરીની કાર્યપદ્ધતિ: નમૂનાથી ૩ડી મોડેલ સુધીની સફર
ક્રાયો-EM માં ડેટા મેળવવાની અને તેની માહિતી વિશ્લેષિત કરવાની એક અત્યંત ચોક્કસ કમ્પ્યુટેશનલ પ્રક્રિયા હોય છે. સૌથી પહેલા થીજેલા નમૂના પરથી અત્યંત ઓછા ડોઝ (low-dose) વાળા ઇલેક્ટ્રોન બીમ પસાર કરવામાં આવે છે જેથી નમૂનાને નુકસાન ન થાય. આનાથી થીજેલા બરફમાં વિખરાયેલા કણોની હજારો કે લાખો દ્વિપરિમાણીય (૨D) છબીઓ કેપ્ચર થાય છે.
ત્યારબાદ સિંગલ પાર્ટીકલ એનાલિસિસ (Single Particle Analysis - SPA) પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરવામાં આવે છે. આ પ્રોસેસમાં RELION અથવા CryoSPARC જેવા શક્તિશાળી કમ્પ્યુટર સોફ્ટવેર વડે લાખો અલગ-અલગ ખૂણાઓમાંથી લેવાયેલી પ્રોટીન કણોની ૨D છબીઓને વર્ગીકૃત (classification) કરવામાં આવે છે. આ બધી છબીઓની સરેરાશ કાઢીને તેમાંથી ૩D ડેન્સિટી મેપ તૈયાર થાય છે, જેના આધારે પ્રોટીનનું સચોટ ૩D મોડેલ બનાવી શકાય છે.
'રિઝોલ્યુશન રેવોલ્યુશન': ડાયરેક્ટ ઇલેક્ટ્રોન ડિટેક્ટરનો ચમત્કાર
૨૦૧૦ ના દાયકામાં ક્રાયો-EM ના ક્ષેત્રમાં એક મોટી ક્રાંતિ આવી જેને વૈજ્ઞાનિક જગતમાં 'રિઝોલ્યુશન રેવોલ્યુશન' (resolution revolution) તરીકે ઓળખવામાં આવે છે. આ ક્રાંતિનું મુખ્ય કારણ ડાયરેક્ટ ઇલેક્ટ્રોન ડિટેક્ટર (Direct Electron Detector - DED) કેમેરાનો અવિષ્કાર હતો. Gatan Inc., FEI અને Direct Electron જેવા ઉત્પાદકો દ્વારા વિકસાવવામાં આવેલા આ ડિટેક્ટર્સ ઇલેક્ટ્રોનને સીધા જ ડીટેક્ટ કરી શકે છે.
આ નવા ડિટેક્ટર્સ અને કમ્પ્યુટેશનલ અલ્ગોરિધમ્સના કારણે રિઝોલ્યુશન સીમા ૨-૩ Å (અંગસ્ટ્રોમ: angstrom) ની નીચે પહોંચી ગઈ. વર્ષ ૨૦૨૦ સુધીમાં ક્રાયો-EM દ્વારા સૌથી શ્રેષ્ઠ ૧.૨૨ Å નું રિઝોલ્યુશન પ્રાપ્ત કરવામાં આવ્યું હતું. વર્ષ ૨૦૧૮ માં વૈજ્ઞાનિકો હીમોગ્લોબિન (hemoglobin - ૬૪ kDa) જેવા નાના પ્રોટીનનું પણ ૧.૮ Å રિઝોલ્યુશન સુધી માપન કરવામાં સફળ રહ્યા હતા.
| લક્ષણ (Feature) | ક્રાયો-EM (Cryo-EM) | એક્સ-રે ક્રિસ્ટલોગ્રાફી (X-ray Crystallography) |
|---|---|---|
| નમૂનાની સ્થિતિ | કુદરતી દ્રાવણમાં (Vitrified) | સ્ફટિકીકૃત (Crystallized) |
| સ્ફટિકીકરણ જરૂરિયાત | કોઈ જરૂર નથી | અત્યંત જરૂરી (મહિનાઓ/વર્ષો લાગે) |
| નમૂનાનો જથ્થો | અત્યંત ઓછો (માઇક્રોગ્રામ) | વધારે જથ્થો જરૂરી |
| શ્રેષ્ઠ રિઝોલ્યુશન | ૧.૨૨ Å (૨૦૨૦) | ૦.૪૮ Å (સર્વોચ્ચ રેકોર્ડ) |
| અણુ કદ મર્યાદા | ૫૦ kDa થી મોટા (સામાન્ય રીતે) | કોઈ ચોક્કસ સીમા નથી |
એક્સ-રે ક્રિસ્ટલોગ્રાફી સાથે સરખામણી
દશકો સુધી જૈવિક અણુઓની રચના જાણવા માટે એક્સ-રે ક્રિસ્ટલોગ્રાફી (X-ray crystallography) નો ઉપયોગ થતો હતો. પરંતુ એક્સ-રે ક્રિસ્ટલોગ્રાફી માટે પ્રોટીનના અતિ શુદ્ધ સ્ફટિકો (crystals) બનાવવાની જરૂર પડે છે, જે પ્રક્રિયામાં મહિનાઓ કે વર્ષો નીકળી જાય છે અને ઘણા મહત્વના પ્રોટીનના ક્રિસ્ટલ બનતા જ નથી. ક્રાયો-EM માં સ્ફટિકીકરણની કોઈ જ જરૂર પડતી નથી, જેના કારણે તે અત્યંત ઝડપી અને સરળ બને છે.
Protein Data Bank (PDB) ના આંકડા મુજબ, એક્સ-રે ક્રિસ્ટલોગ્રાફીનું સરેરાશ રિઝોલ્યુશન ૨.૦૫ Å અને સર્વોચ્ચ રેકોર્ડ ૦.૪૮ Å છે. જોકે ૨૦૧૦ પછી ક્રાયો-EM ના સ્ટ્રક્ચર ડિપોઝિટ્સમાં ભારે ઉછાળો આવ્યો છે. અનુમાન છે કે ૨૦૩૫ સુધીમાં ક્રાયો-EM ના કુલ સ્ટ્રક્ચર ડિપોઝિટ્સ એક્સ-રે ક્રિસ્ટલોગ્રાફીને પણ વટાવી જશે.
વર્તમાન મર્યાદાઓ અને ભવિષ્યની દિશા
ક્રાયો-EM ની પણ કેટલીક મર્યાદાઓ રહેલી છે. સામાન્ય રીતે ૫૦ kDa (કિલોડાલ્ટન) થી નાના પ્રોટીનમાં સિગ્નલ-ટુ-નોઇઝ રેશિયો (Signal-to-Noise Ratio - SNR) ઓછો હોવાથી તેમનું ૩D રિઝોલ્યુશન મેળવવું મુશ્કેલ બને છે. આ સમસ્યા દૂર કરવા માટે વૈજ્ઞાનિકો નેનોબોડીઝ (nanobodies) અને DARPins જેવા મોલેક્યુલર બાઇન્ડિંગ એજન્ટ્સનો ઉપયોગ કરીને પ્રોટીનનું અસરકારક કદ વધારે છે.
આ ઉપરાંત Titan Krios જેવા આધુનિક ક્રાયો-ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપની કિંમત કરોડો ડોલર હોય છે અને તેને સેટ કરવા માટે અત્યંત વિશિષ્ટ સાયન્ટિફિક પ્રયોગશાળાની જરૂર પડે છે. તેમ છતાં, કેન્સર સંશોધન, વાયરસ સ્ટડી અને નવી દવાઓ બનાવવાની ટેકનોલોજી (drug discovery) માં ક્રાયો-EM આજે માનવજાત માટે અત્યંત મહત્વનું સાધન સાબિત થઈ રહ્યું છે.
